發(fā)布時間:2012-12-10 20:23:05
1．有機溶劑的選擇：有機溶劑沉淀蛋白質的能力隨蛋白質的種類及有機溶劑的種類而不同。對曲霉淀粉酶而言，有機溶劑的沉淀能力，丙酮>異丙醇>乙醇>甲醇。這個順序還受溫度、高溫消泡劑、PH、鹽離子濃度所影響，不是一成不變的。
2．關于有機溶劑的用量：只能根據實驗測定的沉淀曲線，因有機溶劑的沉淀能力受很多因素影響，特別是溶存鹽類與高溫消泡劑的影響尤為濕著。
當存在少量中性鹽（0.1-0.2mol/L以上）時能產生鹽溶作用，蛋白質在有機溶劑水溶液和高溫消泡劑中的溶解度升高。多價陽離子與蛋白質結合，就能使蛋白質在水或有機溶劑中的溶解度降低，因而可以降低使酶沉淀的有機溶劑的濃度。
實踐得到的參考范圍如下：對過濾澄清的枯草桿菌淀粉酶或蛋白酶發(fā)酵液，每容積添加0.2-0.8容積的有機溶劑所得到的分部沉淀中含大量淀粉酶；添加0.8-1.1容積，分部沉淀物中含大量中性蛋白酶；添加1.1-1.4容積，分部沉淀物中含大量堿性蛋白酶。
3．其它變數的影響
(1)溫度：有機溶劑沉淀蛋白質的能力受溫度和高溫消泡劑的影響很大。一般言之，溫度越低沉淀越完全。局部區(qū)域有機溶劑過濃，能夠嚴重破壞蛋白質的空間結構造成酶的變性失活，在溫度較高的條件下尤為顯著。有機溶劑，特別是乙醇與水混合時放出大量熱，使混合液的溫度升高。因此在添加有機溶劑時，整個系統(tǒng)需要冷卻，一般保持0℃左右，同時強烈攪拌，以避免有機溶劑局部過濃和液體局部過熱，而高溫消泡劑則無事。另外，已經沉淀的酶對有機溶劑變性的抵抗力大，所以，過分延長添加溶劑的時間也是不利的。
(2) pH：蛋白質在等電點的溶解度最低，但很多酶的等電點在pH4-5，比其穩(wěn)定的pH范圍低。在這種情況下必須采用目的酶穩(wěn)定的pH，然后是盡可能靠近其等電點。
沉淀時酶液的溫度、高溫消泡劑和pH不但對目的酶的收率具有決定性的影響，而且對酶的組成（各共存酶的比率）及單位重量沉淀物中目的酶的活力都有重要的關系。例如，固體培養(yǎng)的米曲霉ɑ-淀粉酶，用水抽出并過濾，清液預先冷卻，在攪拌下加乙醇至終濃度70%，溫度10℃，pH 5.6-6.0，ɑ-淀粉酶的收率約94%。
有機溶劑沉淀法有使酶變性失活的傾向，不如鹽析法安全；有機溶劑還能使發(fā)酵液中的多糖類雜質沉淀，沉淀物中有機雜質多；另外分部沉淀的靈敏性方面也不如鹽析法。
為了節(jié)省沉淀酶用的有機溶劑量，澄清的酶液應當先在減壓條件下濃縮。但減壓濃縮的倍數是很有限的，對枯草桿菌酶發(fā)酵液的澄清液，一般只能濃縮到原體積的40-50%，否則有機溶劑的沉淀物呈膠糖狀，很難處理。但若在濃縮的酶液中先加入一定量的高嶺土、硅藻土之類，加有機溶劑與高溫消泡劑后酶的沉淀就分散在這些載體上，沉淀物就比較容易收集。有機溶劑沉淀物特別適宜于用離心分離法收集。
本文參考《發(fā)酵微生物學》一書。
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